A. TANAMAN
WORTEL
Wortel (Daucus carota) adalah tumbuhan jenis sayuran
umbi yang
biasanya berwarna jingga atau putih dengan tekstur serupa kayu. Bagian yang
dapat dimakan dari wortel adalah bagian umbi
atau akarnya. Batang bunga tumbuh setinggi sekitar 1 m, dengan bunga berwarna
putih.Tanaman wortel berupa rumput dan menyimpan cadangan makanannya di dalam
umbi. Mempunyai batang pendek, basah, berakar tunggang, sekumpulan tangkai daun
yang keluar dari ujung umbi bagian atas yang bentuk dan fungsinya berubah
menjadi umbi bulat dan memanjang. Umbi berwarna kuning kemerah-merahan,
berkulit tipis, dan jika dimakan mentah terasa renyah dan agak manis.
Secara keseluruhan tanaman wortel paling berkhasiat adalah bagian umbinya. Tanaman wortel banyak ragamnya, tetapi bila dilihat bentuk umbinya ada 3 golongan, yaitu :
a) Tipe Chantenay, berbentuk bulat panjang dengan ujung yang tumpul.
b) Tipe Imperator, berbentuk bulat panjang dengan ujung runcing.
c) Tipe Nantes, merupakan tipe gabungan antara imperator dan chantenay.
Kandungan kimia
Wortel segar mengandung air, protein, karbohidrat, lemak, serat, abu, nutrisi anti kanker, gula alamiah (fruktosa, sukrosa, dektrosa, laktosa, dan maltosa), pektin, glutation, mineral (kalsium, fosfor, besi, kalium, natrium, magnesium, kromium), vitamin (beta karoten, B1, dan C) serta asparagine (Dalimartha, 2001). Daun wortel mengandung pektin, kalsium, fosfor, besi, kalium, natrium, magnesium, kromium, serta asparagin (Anonim, 2007). Selain itu juga mengandung saponin dan tanin (Syamsuhidayat dan Hutapea, 1993).
B. INISIASI KULTUR
Tujuan utama dari propagasi
secara in-vitro tahap ini adalah pembuatan kultur dari eksplan yang bebas
mikroorganisme serta inisiasi pertumbuhan baru (Wetherell, 1976). Menurut
Yusnita, 2004, bahwa pada tahap ini mengusahakan kultur yang aseptik atau
aksenik. Aseptik berarti bebas dari mikroorganisme, sedangkan aksenik berarti
bebas dari mikroorganisme yang tidak diinginkan. Dalam tahap ini juga
diharapkan bahwa eksplan yang dikulturkan akan menginisiasi pertumbuhan baru,
sehingga akan memungkinkan dilakukannya pemilihan bagian tanaman yang tumbuhnya
paling kuat,untuk perbanyakan (multiplikasi) pada kultur tahap selanjutnya
(Wetherell, 1976).
Untuk mendapakan kultur yang bebas dari kontaminasi, eksplan harus disterilisasi. Sterilisasi merupakan upaya untuk menghilangkan kontaminan mikroorganisme yang menempel di permukaan eksplan. beberapa bahan kimia yang dapat digunakan untuk mensterilkan permukaan eksplan adalah NaOCl, CaOCl2, etanol, dan HgCl2.
Kesesuaian bagian tanaman untuk dijadikan eksplan, dipengaruhi oleh banyak faktor. Tanaman yang memiliki hubungan kekerabatan dekat pun, belum tentu menunjukkan respon in-vitro yang sama (Wetherell, 1976). Penggunaan eksplan yang tepat merupakan hal penting yang juga harus diperhatikan pada tahap ini. Umur fisiologis dan ontogenetik tanaman induk, serta ukuran eksplan bagian tanaman yang digunakan sebagai eksplan, merupakan faktor penting dalam tahap ini. Bagi kebanyakan tanaman, eksplan yang sering digunakan adalah tunas pucuk (tunas apikal) atau mata tunas lateral pada potongan batang berbuku. Namun belakangan ini, eksplan potongan daun yang dulunya hanya digunakan untuk tanaman-tanaman herba, seperti violces, begonia, petunia dan tomat, ternyata dapat digunakan juga untuk tanaman-tanaman berkayu seperti Ficus lyrata, Annona squamosa, dan melinjo. Eksplan yang dapat digunakan untuk memperbanyak tanaman Anthurium sendiri diantaranya adalah tunas pucuk, daun, tangkai daun muda, tangkai bunga, spate, spandik, biji, ruas batang dan anther.
Umur fisiologis dan umur ontogenetik jaringan tanaman yang dijadikan eksplan juga berpengaruh terhadap potensi morfogenetiknya. Umumnya, eksplan yang berasal dari tanaman juvenile mempunyai daya regenerasi tinggi untuk membentuk tunas lebih cepat dibandingakan dengan eksplan yang berasal dari tanaman yang sudah dewasa.
Masalah yang sering dihadapi pada kultur tahap ini adalah terjadinya pencokelatan atau penghitaman bagian eksplan (browning). Hal ini disebabkan oleh senyawa fenol yang timbul akibat stress mekanik yang timbul akibat pelukaan pada waktu proses isolasi eksplan dari tanaman induk. Senyawa fenol tersebut bersifat toksik, menghambat pertumbuhan atau bahkan dapat mematikan jaringan eksplan.
C. KULTUR KALUS
Kalus adalah suatu kumpulan sel
amorphous yang terjadi dari sel-sel jaringan yang membelah diri secara terus
menerus. Penelitian pembentukan kalus pada jaringan terluka pertama kali
dilakukan oleh Sinnott pada tahun 1960. Pembentukan kalus pada jaringan luka
dipacu oleh zat pengatur tumbuh auksin dan sitokinin endogen (Dodds &
Roberts, 1983). Secara in vivo, kalus pada umumnya terbentuk pada bekas-bekas
luka akibat serangan infeksi mikro organisme seperti Agrobacterium tumefaciens,
gigitan atau tusukan serangga dan nematoda. Kalus juga dapat terbentuk sebagai
akibat stress (George & Sherrington, 1984). Kalus yang diakibatkan oleh
hasil dari infeksi bakteri Agrobacterium tumefaciens disebut tumor.
Tujuan kultur kalus adalah untuk memperoleh kalus dari eksplan yang diisolasi dan ditumbuhkan dalam lingkungan terkendali. Kalus diharapkan dapat memperbanyak dirinya (massa selnya) secara terus menerus.
Sel-sel penyusun kalus berupa sel parenkim yang mempunyai ikatan yang renggang dengan sel-sel lain. Dalam kultur jaringan, kalus dapat dihasilkan dari potongan organ yang telah steril, di dalam media yang mengandung auksin dan kadang-kadang juga sitokinin. Organ tersebut dapat berupa kambium vaskular, parenkhim cadangan makanan, perisikle, kotiledon, mesofil daun dan jaringan provaskular. Kalus mempunyai pertumbuhan yang abnormal dan berpotensi untuk berkembang menjadi akar, tunas dan embrioid yang nantinya akan dapat membentuk plantlet.
Beberapa kalus ada yang mengalami pembentukan lignifikasi sehingga kalus tersebut mempunyai tekstur yang keras dan kompak. Namun ada kalus yang tumbuh terpisah-pisah menjadi fragmen-fragmen yang kecil, kalus yang demikian dikenal dengan kalus remah (friable). Warna kalus dapat bermacam-macam tergantung dari jenis sumber eksplan itu diambil, seperti warna kekuning-kuningan, putih, hijau, atau kuning kejingga-jingaan. (karena adanya pigmen antosianin ini terdapat pada kalus kortek umbi wortel).
Pada umumnya untuk eksplan yang mempunyai kambium tidak perlu penambahan ZPT untuk menginduksi terbentuknya kalus karena secara alamiah pada jaringan berkambium yang mengalami luka akan tumbuh kalus untuk menutupi luka yang terbuka. Namun pada kasus lain, menurut Kordan (1959 dalam Dodds & Robert, 1983) keberadaan kambium di dalam eksplan tertentu dapat menghambat pertumbuhan kalus bila tanpa penambahan zat pengatur tumbuh eksogen. Penambahan ZPT tersebut dapat satu macam atau lebih tergantung dari jenis eksplan yang digunakan. Pembelahan sel di dalam eksplan dapat terjadi tergantung dari ZPT yang digunakan, seperti auksin, sitokinin, auksin dan sitokinin, dan ekstrak senyawa organik komplek alamiah.
Berdasarkan kebutuhan akan zat pengatur tumbuh untuk membentuk kalus, jaringan tanaman digolongkan dalam 4 kelompok:
1) Jaringan tanaman yang membutuhkan hanya auksin selain gula dan garam-garam mineral untuk dapat membentuk kalus seperti umbi artichoke
2) Jaringan yang memerlukan auksin dan sitokinin selain gula dan garam-garam mineral
3) Jaringan yang tidak perlu auksin dan sitokinin, hanya gula dan garam-garam mineral seperti jaringan cambium
4) Jaringan yang membentuk hanya sitokinin, gula dan garam-garam mineral seperti parenkim dan xylem akar turnip.
Pada umumnya kemampuan pembentukkan kalus dari jaringan tergantung juga dari:
1) Umur fisiologi dari jaringan waktu diisolasi
2) Musim pada waktu bahan tanaman diisolasi
3) Bagian tanaman yang dipakai
4) Jenis tanaman
Kalus dapat diinisiasi dari hampir semua bagian tanaman, tetapi organ yang berbeda menunjukkan kecepatan pembelahan sel yang berbeda pula. Jenis tanaman yang menghasilkan kalus, meliputi dikotil berdaun lebar, monokotil, gymnospermae, pakis dan moss. Bagian tanaman seperti embrio muda, hipokotil, kotiledon dan batang muda merupakan bagian yang mudah untuk dediferensiasi dan menghasilkan kalus. Suatu sifat yang diamati dalam jaringan yang membentuk kalus adalah bahwa pembelahan sel tidak terjadi pada semua sel dalam jaringan asal, tetapi hanya sel di lapisan perisfer yang membelah terus menerus sedangkan sel-sel di tengah tetap quiscent. Faktor-faktor yang menyebabkan inisiasi pembelahan sel hanya terbatas di lapisan luar dari jaringan kalus, adalah:
1) Ketersediaan oksigen yang lebih tinggi
2) Keluarnya gas CO2
3) Kesediaan hara yang lebih banyak
4) Penghambat yang bersifat folatik lebih cepat menguap
5) Cahaya
Dalam mempelajari proses pembentukan kalus sebagai akibat perlakuan, empat lapisan sel yang berbeda dalam wortel yang dikultur pada berbagai media. Lapisan-lapisan sel yang berbeda terlihat jelas tiga hari setelah kultur terdiri:
1) Lapisan luar dengan sel-sel yang pecah
2) Lapisan kedua terdiri dari dua lapisan sel dorman
3) Lapisan dengan sel yang aktif membelah, terdiri dari 1-6 lapis
4) Lapisan tengah (core) yang sel-selnya tidak membelah.
Induksi kalus dalam jaringan wortel ini, disertai dengan aktifitas enzim-enzim NAD-diaphorase succinic dehydrogenase dan cytochrome oxidase yang meningkat. Kenaikan aktifitas enzim terutama dalam lapisan sel yang sedang membelah. Dalam jaringan ini juga ditemukan aktifitas asam fosfatase. Pada kultur artichoke, enzim fosfatase diditeksi pada permukaan sel-sel yang tidak membelah. Menurut hipotesa Yeoman pada tahun 1970, asam fosfatase berhubungan dengan sel rusak dan enzim ini adalah index autolysis sel. Pada sel yang rusak tapi tidak pecah di lapisan perisfer, terjadi autolisis dan sel-sel yang rusak tersebut mengeluarkan persenyawaan yang dapat memacu pembelahan sel di lapisan berikutnya.
Eksplan batang, akar dan daun menghasilkan kalus yang heterogen dengan berbagai macam sel. Kadang-kadang jaringan yang kelihatannya seragam histologinya, ternyata menghasilkan kalus dengan sel yang mempunyai DNA yang berbeda yang mencerminkan level ploidi yang berbeda. Begitupun pada kultur akar kalus yang dihasilkan dapat berupa campuran sel dengan tingkat ploidi yang berbeda.
Sel-sel yang heterogen dari jaringan yang komplek menunjukkan pertumbuhan yang berbeda. Dengan mengubah komposisi media, terjadi seleksi sel-sel yang mempunyai sifat khusus. Hal ini berarti bahwa media tumbuh menentukan komposisi kalus. Sel yang jumlahnya paling banyak merupakan sel-sel yang paling cepat membelah dan sel yang paling sedikit adalah sel yang paling lambat pertumbuhannya. Media seleksi dapat berdasarkan unsur-unsur hara atau zat pengatur tumbuh yang ditambahkan ke dalam media.
Sel heterogen berasal dari materi asal yang heterogen pula, atau dapat terjadi karena massa kultur yang panjang melalui sub kultur yang berkali-kali. Perubahan yang terjadi dapat merupakan:
1) Aberasi kromosom
2) endo-reduplikasi yang menghasilkan poloploidi
3) Amplifikasi gen, jumlah gen untuk suatu sifat tertentu per genome haploid bertambah
4) Hilangnya suatu gen (deletion)
5) Mutasi gen
6) Transposisi urutan DNA (DNA sequences transposition)
Kecepatan perubahan-perubahan dalam kromosom ini, tergantung juga dari macam media yang digunakan, serta jenis tanamannya. Ketidakstabilan kromosom ini menyulitkan aplikasi kultur kalus untuk perbanyakan maupun untuk produksi bahan-bahan/persenyawaan sekunder. Sebaliknya ketidak-stabilan tersebut dapat dipergunakan dalam seleksi dan pemuliaan invitro, untuk memperoleh sifat-sifat baru yang menguntungkan seperti resistensi terhadap penyakit, hilangnya morfologi yang memang tidak diinginkan seperti duri atau warna pada bunga.
Street (1969 dalam Dodds & Robert 1983) menyarankan massa sel yang dipindahkan pada subkultur harus cukup banyak antara 5-10 mm atau seberat 20-100 mg, supaya ada pertumbuhan yang cepat dalam media baru. Subkultur sebaiknya dilakukan 28 hari sekali (4-6 minggu sekali). Namun waktu yang tepat untuk memindahkan kultur, tergantung dari kecepatan pertumbuhan kalus. Massa kalus ada 2 macam yaitu massa yang remah (friable) dan kompak. Bila massa kalus remah maka pemindahan kalus cukup dilakukan dengan menyendok kalus dengan spatula atau skapel langsung disubkultur ke media baru. Namun bila kalus kompak mesti dipindah ke petridish steril untuk dipotong-potong dengan skapel baru disubkultur ke media baru. Kalus yang sudah mengalami nekrosis (pencoklatan) sebaiknya tidak ikut disubkultur karena tidak akan tumbuh dengan baik.
D. KULTUR SUSPENSI
Kultur suspensi sel adalah pemeliharaan sel, tunggal maupun gabungan beberapa sel, dalam medium cair dan lingkungan buatan yang steril. Kultur suspensi sel terdiri atas populasi sel dengan laju pertumbuhan yang cepat karena seluruh permukaan sel dapat kontak langsung dengan medium nutrisi. Hal ini menyebabkan metabolisme sel lebih tinggi jika dibandingkan dengan kultur kalus (George & Sherrington, 1984).
Metode kultur suspensi sel dapat digunakan sebagai sarana untuk produksi metabolit sekunder. Hal ini dapat terjadi karena setiap sel tumbuhan yang diisolasi dari tumbuhan induknya mempunyai potensi genetik dan fisiologi yang sama dengan induknya, atau yang dikenal dengan nama sifat totipotensi. Sifat ini menyebabkan metabolit sekunder yang dihasilkan oleh tanaman induk dapat pula dihasilkan pada sel yang dikultur secara in vitro (Fowler, 1981 dalam Mantell & Smith, 1983).
Kultur suspensi sel dapat diperoleh dengan cara memindahkan kalus dari medium padat ke medium cair dalam kondisi agitasi selama periode kultur dalam waktu tertentu. George & Sherrington (1984) menyatakan bahwa dalam kondisi agitasi, kalus meremah akan terpisah membentuk kelompok sel dan sel-sel tunggal. Sel-sel tunggal akan mengadakan pembelahan membentuk kelompok-kelompok sel yang kemudian terpisah lagi membentuk sel-sel tunggal dan kelompok-keompok sel yang lebih kecil.
Diameter sel pada kultur suspensi sel pada umumnya berkisar antara 20-150 µm dan panjang 100-200 µm. Ukuran ini setara dengan 10-100 kali bakteri atau fungi dan mempunyai panjang maksimal 2 mm serta mengandung 2-200 sel (Endress, 1994). Pada fase pertumbuhan logaritmik pada masa awal kultur sel, sel-sel berbentuk kecil dan dipenuhi dengan sitoplasma. Namun pada fase stasioner, sel-sel ini memiliki ukuran tertentu, sel lebih tua dan memiliki vakuola besar di pusat sel (Endress, 1994).
1. Alat yang digunakan untuk inisiasi wortel
2. Bahan yang
digunakanuntuk inisiasi wortel
Wortel (Daucus carota) adalah tumbuhan jenis sayuran
umbi yang
biasanya berwarna jingga atau putih dengan tekstur serupa kayu. Bagian yang
dapat dimakan dari wortel adalah bagian umbi
atau akarnya. Batang bunga tumbuh setinggi sekitar 1 m, dengan bunga berwarna
putih.Tanaman wortel berupa rumput dan menyimpan cadangan makanannya di dalam
umbi. Mempunyai batang pendek, basah, berakar tunggang, sekumpulan tangkai daun
yang keluar dari ujung umbi bagian atas yang bentuk dan fungsinya berubah
menjadi umbi bulat dan memanjang. Umbi berwarna kuning kemerah-merahan,
berkulit tipis, dan jika dimakan mentah terasa renyah dan agak manis.Secara keseluruhan tanaman wortel paling berkhasiat adalah bagian umbinya. Tanaman wortel banyak ragamnya, tetapi bila dilihat bentuk umbinya ada 3 golongan, yaitu :
a) Tipe Chantenay, berbentuk bulat panjang dengan ujung yang tumpul.
b) Tipe Imperator, berbentuk bulat panjang dengan ujung runcing.
c) Tipe Nantes, merupakan tipe gabungan antara imperator dan chantenay.
Kandungan kimia
Wortel segar mengandung air, protein, karbohidrat, lemak, serat, abu, nutrisi anti kanker, gula alamiah (fruktosa, sukrosa, dektrosa, laktosa, dan maltosa), pektin, glutation, mineral (kalsium, fosfor, besi, kalium, natrium, magnesium, kromium), vitamin (beta karoten, B1, dan C) serta asparagine (Dalimartha, 2001). Daun wortel mengandung pektin, kalsium, fosfor, besi, kalium, natrium, magnesium, kromium, serta asparagin (Anonim, 2007). Selain itu juga mengandung saponin dan tanin (Syamsuhidayat dan Hutapea, 1993).
B. INISIASI KULTUR
Untuk mendapakan kultur yang bebas dari kontaminasi, eksplan harus disterilisasi. Sterilisasi merupakan upaya untuk menghilangkan kontaminan mikroorganisme yang menempel di permukaan eksplan. beberapa bahan kimia yang dapat digunakan untuk mensterilkan permukaan eksplan adalah NaOCl, CaOCl2, etanol, dan HgCl2.
Kesesuaian bagian tanaman untuk dijadikan eksplan, dipengaruhi oleh banyak faktor. Tanaman yang memiliki hubungan kekerabatan dekat pun, belum tentu menunjukkan respon in-vitro yang sama (Wetherell, 1976). Penggunaan eksplan yang tepat merupakan hal penting yang juga harus diperhatikan pada tahap ini. Umur fisiologis dan ontogenetik tanaman induk, serta ukuran eksplan bagian tanaman yang digunakan sebagai eksplan, merupakan faktor penting dalam tahap ini. Bagi kebanyakan tanaman, eksplan yang sering digunakan adalah tunas pucuk (tunas apikal) atau mata tunas lateral pada potongan batang berbuku. Namun belakangan ini, eksplan potongan daun yang dulunya hanya digunakan untuk tanaman-tanaman herba, seperti violces, begonia, petunia dan tomat, ternyata dapat digunakan juga untuk tanaman-tanaman berkayu seperti Ficus lyrata, Annona squamosa, dan melinjo. Eksplan yang dapat digunakan untuk memperbanyak tanaman Anthurium sendiri diantaranya adalah tunas pucuk, daun, tangkai daun muda, tangkai bunga, spate, spandik, biji, ruas batang dan anther.
Umur fisiologis dan umur ontogenetik jaringan tanaman yang dijadikan eksplan juga berpengaruh terhadap potensi morfogenetiknya. Umumnya, eksplan yang berasal dari tanaman juvenile mempunyai daya regenerasi tinggi untuk membentuk tunas lebih cepat dibandingakan dengan eksplan yang berasal dari tanaman yang sudah dewasa.
Masalah yang sering dihadapi pada kultur tahap ini adalah terjadinya pencokelatan atau penghitaman bagian eksplan (browning). Hal ini disebabkan oleh senyawa fenol yang timbul akibat stress mekanik yang timbul akibat pelukaan pada waktu proses isolasi eksplan dari tanaman induk. Senyawa fenol tersebut bersifat toksik, menghambat pertumbuhan atau bahkan dapat mematikan jaringan eksplan.
C. KULTUR KALUS
Tujuan kultur kalus adalah untuk memperoleh kalus dari eksplan yang diisolasi dan ditumbuhkan dalam lingkungan terkendali. Kalus diharapkan dapat memperbanyak dirinya (massa selnya) secara terus menerus.
Sel-sel penyusun kalus berupa sel parenkim yang mempunyai ikatan yang renggang dengan sel-sel lain. Dalam kultur jaringan, kalus dapat dihasilkan dari potongan organ yang telah steril, di dalam media yang mengandung auksin dan kadang-kadang juga sitokinin. Organ tersebut dapat berupa kambium vaskular, parenkhim cadangan makanan, perisikle, kotiledon, mesofil daun dan jaringan provaskular. Kalus mempunyai pertumbuhan yang abnormal dan berpotensi untuk berkembang menjadi akar, tunas dan embrioid yang nantinya akan dapat membentuk plantlet.
Beberapa kalus ada yang mengalami pembentukan lignifikasi sehingga kalus tersebut mempunyai tekstur yang keras dan kompak. Namun ada kalus yang tumbuh terpisah-pisah menjadi fragmen-fragmen yang kecil, kalus yang demikian dikenal dengan kalus remah (friable). Warna kalus dapat bermacam-macam tergantung dari jenis sumber eksplan itu diambil, seperti warna kekuning-kuningan, putih, hijau, atau kuning kejingga-jingaan. (karena adanya pigmen antosianin ini terdapat pada kalus kortek umbi wortel).
Pada umumnya untuk eksplan yang mempunyai kambium tidak perlu penambahan ZPT untuk menginduksi terbentuknya kalus karena secara alamiah pada jaringan berkambium yang mengalami luka akan tumbuh kalus untuk menutupi luka yang terbuka. Namun pada kasus lain, menurut Kordan (1959 dalam Dodds & Robert, 1983) keberadaan kambium di dalam eksplan tertentu dapat menghambat pertumbuhan kalus bila tanpa penambahan zat pengatur tumbuh eksogen. Penambahan ZPT tersebut dapat satu macam atau lebih tergantung dari jenis eksplan yang digunakan. Pembelahan sel di dalam eksplan dapat terjadi tergantung dari ZPT yang digunakan, seperti auksin, sitokinin, auksin dan sitokinin, dan ekstrak senyawa organik komplek alamiah.
Berdasarkan kebutuhan akan zat pengatur tumbuh untuk membentuk kalus, jaringan tanaman digolongkan dalam 4 kelompok:
1) Jaringan tanaman yang membutuhkan hanya auksin selain gula dan garam-garam mineral untuk dapat membentuk kalus seperti umbi artichoke
2) Jaringan yang memerlukan auksin dan sitokinin selain gula dan garam-garam mineral
3) Jaringan yang tidak perlu auksin dan sitokinin, hanya gula dan garam-garam mineral seperti jaringan cambium
4) Jaringan yang membentuk hanya sitokinin, gula dan garam-garam mineral seperti parenkim dan xylem akar turnip.
Pada umumnya kemampuan pembentukkan kalus dari jaringan tergantung juga dari:
1) Umur fisiologi dari jaringan waktu diisolasi
2) Musim pada waktu bahan tanaman diisolasi
3) Bagian tanaman yang dipakai
4) Jenis tanaman
Kalus dapat diinisiasi dari hampir semua bagian tanaman, tetapi organ yang berbeda menunjukkan kecepatan pembelahan sel yang berbeda pula. Jenis tanaman yang menghasilkan kalus, meliputi dikotil berdaun lebar, monokotil, gymnospermae, pakis dan moss. Bagian tanaman seperti embrio muda, hipokotil, kotiledon dan batang muda merupakan bagian yang mudah untuk dediferensiasi dan menghasilkan kalus. Suatu sifat yang diamati dalam jaringan yang membentuk kalus adalah bahwa pembelahan sel tidak terjadi pada semua sel dalam jaringan asal, tetapi hanya sel di lapisan perisfer yang membelah terus menerus sedangkan sel-sel di tengah tetap quiscent. Faktor-faktor yang menyebabkan inisiasi pembelahan sel hanya terbatas di lapisan luar dari jaringan kalus, adalah:
1) Ketersediaan oksigen yang lebih tinggi
2) Keluarnya gas CO2
3) Kesediaan hara yang lebih banyak
4) Penghambat yang bersifat folatik lebih cepat menguap
5) Cahaya
Dalam mempelajari proses pembentukan kalus sebagai akibat perlakuan, empat lapisan sel yang berbeda dalam wortel yang dikultur pada berbagai media. Lapisan-lapisan sel yang berbeda terlihat jelas tiga hari setelah kultur terdiri:
1) Lapisan luar dengan sel-sel yang pecah
2) Lapisan kedua terdiri dari dua lapisan sel dorman
3) Lapisan dengan sel yang aktif membelah, terdiri dari 1-6 lapis
4) Lapisan tengah (core) yang sel-selnya tidak membelah.
Induksi kalus dalam jaringan wortel ini, disertai dengan aktifitas enzim-enzim NAD-diaphorase succinic dehydrogenase dan cytochrome oxidase yang meningkat. Kenaikan aktifitas enzim terutama dalam lapisan sel yang sedang membelah. Dalam jaringan ini juga ditemukan aktifitas asam fosfatase. Pada kultur artichoke, enzim fosfatase diditeksi pada permukaan sel-sel yang tidak membelah. Menurut hipotesa Yeoman pada tahun 1970, asam fosfatase berhubungan dengan sel rusak dan enzim ini adalah index autolysis sel. Pada sel yang rusak tapi tidak pecah di lapisan perisfer, terjadi autolisis dan sel-sel yang rusak tersebut mengeluarkan persenyawaan yang dapat memacu pembelahan sel di lapisan berikutnya.
Eksplan batang, akar dan daun menghasilkan kalus yang heterogen dengan berbagai macam sel. Kadang-kadang jaringan yang kelihatannya seragam histologinya, ternyata menghasilkan kalus dengan sel yang mempunyai DNA yang berbeda yang mencerminkan level ploidi yang berbeda. Begitupun pada kultur akar kalus yang dihasilkan dapat berupa campuran sel dengan tingkat ploidi yang berbeda.
Sel-sel yang heterogen dari jaringan yang komplek menunjukkan pertumbuhan yang berbeda. Dengan mengubah komposisi media, terjadi seleksi sel-sel yang mempunyai sifat khusus. Hal ini berarti bahwa media tumbuh menentukan komposisi kalus. Sel yang jumlahnya paling banyak merupakan sel-sel yang paling cepat membelah dan sel yang paling sedikit adalah sel yang paling lambat pertumbuhannya. Media seleksi dapat berdasarkan unsur-unsur hara atau zat pengatur tumbuh yang ditambahkan ke dalam media.
Sel heterogen berasal dari materi asal yang heterogen pula, atau dapat terjadi karena massa kultur yang panjang melalui sub kultur yang berkali-kali. Perubahan yang terjadi dapat merupakan:
1) Aberasi kromosom
2) endo-reduplikasi yang menghasilkan poloploidi
3) Amplifikasi gen, jumlah gen untuk suatu sifat tertentu per genome haploid bertambah
4) Hilangnya suatu gen (deletion)
5) Mutasi gen
6) Transposisi urutan DNA (DNA sequences transposition)
Kecepatan perubahan-perubahan dalam kromosom ini, tergantung juga dari macam media yang digunakan, serta jenis tanamannya. Ketidakstabilan kromosom ini menyulitkan aplikasi kultur kalus untuk perbanyakan maupun untuk produksi bahan-bahan/persenyawaan sekunder. Sebaliknya ketidak-stabilan tersebut dapat dipergunakan dalam seleksi dan pemuliaan invitro, untuk memperoleh sifat-sifat baru yang menguntungkan seperti resistensi terhadap penyakit, hilangnya morfologi yang memang tidak diinginkan seperti duri atau warna pada bunga.
Street (1969 dalam Dodds & Robert 1983) menyarankan massa sel yang dipindahkan pada subkultur harus cukup banyak antara 5-10 mm atau seberat 20-100 mg, supaya ada pertumbuhan yang cepat dalam media baru. Subkultur sebaiknya dilakukan 28 hari sekali (4-6 minggu sekali). Namun waktu yang tepat untuk memindahkan kultur, tergantung dari kecepatan pertumbuhan kalus. Massa kalus ada 2 macam yaitu massa yang remah (friable) dan kompak. Bila massa kalus remah maka pemindahan kalus cukup dilakukan dengan menyendok kalus dengan spatula atau skapel langsung disubkultur ke media baru. Namun bila kalus kompak mesti dipindah ke petridish steril untuk dipotong-potong dengan skapel baru disubkultur ke media baru. Kalus yang sudah mengalami nekrosis (pencoklatan) sebaiknya tidak ikut disubkultur karena tidak akan tumbuh dengan baik.
D. KULTUR SUSPENSI
Kultur suspensi sel adalah pemeliharaan sel, tunggal maupun gabungan beberapa sel, dalam medium cair dan lingkungan buatan yang steril. Kultur suspensi sel terdiri atas populasi sel dengan laju pertumbuhan yang cepat karena seluruh permukaan sel dapat kontak langsung dengan medium nutrisi. Hal ini menyebabkan metabolisme sel lebih tinggi jika dibandingkan dengan kultur kalus (George & Sherrington, 1984).
Metode kultur suspensi sel dapat digunakan sebagai sarana untuk produksi metabolit sekunder. Hal ini dapat terjadi karena setiap sel tumbuhan yang diisolasi dari tumbuhan induknya mempunyai potensi genetik dan fisiologi yang sama dengan induknya, atau yang dikenal dengan nama sifat totipotensi. Sifat ini menyebabkan metabolit sekunder yang dihasilkan oleh tanaman induk dapat pula dihasilkan pada sel yang dikultur secara in vitro (Fowler, 1981 dalam Mantell & Smith, 1983).
Kultur suspensi sel dapat diperoleh dengan cara memindahkan kalus dari medium padat ke medium cair dalam kondisi agitasi selama periode kultur dalam waktu tertentu. George & Sherrington (1984) menyatakan bahwa dalam kondisi agitasi, kalus meremah akan terpisah membentuk kelompok sel dan sel-sel tunggal. Sel-sel tunggal akan mengadakan pembelahan membentuk kelompok-kelompok sel yang kemudian terpisah lagi membentuk sel-sel tunggal dan kelompok-keompok sel yang lebih kecil.
Diameter sel pada kultur suspensi sel pada umumnya berkisar antara 20-150 µm dan panjang 100-200 µm. Ukuran ini setara dengan 10-100 kali bakteri atau fungi dan mempunyai panjang maksimal 2 mm serta mengandung 2-200 sel (Endress, 1994). Pada fase pertumbuhan logaritmik pada masa awal kultur sel, sel-sel berbentuk kecil dan dipenuhi dengan sitoplasma. Namun pada fase stasioner, sel-sel ini memiliki ukuran tertentu, sel lebih tua dan memiliki vakuola besar di pusat sel (Endress, 1994).
1. Alat yang digunakan untuk inisiasi wortel
-
Wadah
-
Pisau- Talenan - Backer glass - Spatula - Semprotan - Botol kultur - Laminar Air Flow - Gunting |
-
Kertas steril
-
Pisau scalpel- Lampu Bunsen - Petridis - Batang pengaduk - Botol semprot - Label - Pinset |
-
Beberapa buah wortel
- Detergen (sunlight)
- Aquadest
- Aquadest steril
- Bakterisida
- Fungisida
- Air untuk mencuci
- Baycline
- Media MS0 2,4 D
- Alkohol
- Detergen (sunlight)
- Aquadest
- Aquadest steril
- Bakterisida
- Fungisida
- Air untuk mencuci
- Baycline
- Media MS0 2,4 D
- Alkohol
C. Prosedur Kerja
Ø Menyiapkan semua alat dan bahan yang diperlukan.
Ø Menyiapkan LAFC, dengan cara menyalakan lampu UV 30 menit sebelum digunakan, setelah 30menit kemudian memadamkan lampu UV lalu menyalakan lampu TL dan blower.
Ø Memotong kedua ujung wortel yang telah disiapkan lalu mengupasnya.
Ø Memotong wortel dengan panjang + 5cm, kemudian mencuci wortel dengan aquadest sebanyak 2 kali.
Ø Mencuci wortel menggunakan deterjen, kemudian membilas wortel dengan aquadest hingga bersih.
Ø Menyemprot tangan menggunakan alkohol 70% sebelum bekerja dalam LAFC. (kegiatan berikutnya mulai dilakukan di dalam LAFC yang telah disiapkan sebelumnya)
Ø Merendam wortel yang telah bersih dengan larutan bakterisida dan fungisida pada konsentrasi 2gr/ liter selama 15 menit.
Ø Membilas wortel dengan aquadest steril sebanyak 3 kali.
Ø Merendam wortel dengan larutan pemutih (NaOCl) 20% selama 5 menit, kemudian membilasnya dengan aquadest steril.
Ø Merendam wortel dengan larutan pemutih (NaOCl) 15% selama 10 menit, kemudian membilasnya dengan aquadest steril.
Ø Merendam wortel dengan larutan pemutih (NaOCl) 10% selama 15 menit, kemudian membilasnya dengan aquadest steril sebanyak 3 kali.
Ø Memotong bagian pinggir wortel secara vertikal sehingga didapatkan bagian tengah wortel saja.
Ø Mengiris tipis secara horisontal bagian tengah wortel sehingga didapatkan irisan melintang wortel (semakin tipis, semakin baik).
Ø Menanam irisan tipis wortel (eksplan) kedalam media yang telah disiapkan sebanyak 5-8 irisan tergantung diameter permukaan media dalam botol kultur atau cawan petri.
Ø Menutup botol kultur atau cawan petri lalu memanaskan mulut botol atau sekeliling cawan petri diatas lampu bunsen agar steril. (jika menggunakan cawan petri, bagian luar mulut cawan ditutup menggunakan plastik wraping untuk mencegah kontaminasi)
Ø Memberi label pada setiap hasil inisiasi yang memuat informasi mengenai nama komoditas, tanggal penanaman, dan nama penanam.
Ø Menyimpan hasil inisiasi dalam ruang pertumbuhan.
Ø Mengemasi semua alat yang telah digunakan dan mengembalikannya ketempat semula.
Ø Melakukan pengamatan terhadap hasil inisiasi selama dua minggu setelah inisiasi.
Ø Melakukan diskusi, pembahasan dan membuat laporan praktikum.
REFERENSI MATERI : http://naruto3012.wordpress.com/2011/03/29/laporan-inisiasi-wortel/
